如何添加慢病毒量？確定靶細(xì)胞 MOI 值

不論是對活體還是體外培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞，慢病毒表達(dá)載體對遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率至關(guān)重要。慢病毒最早起源于人免疫缺陷病毒 (HIV) 或貓免疫缺陷病毒（FIV），能夠感染幾乎所有類型的細(xì)胞，包括難以用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染甚至無法用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

許多客戶對如何用慢病毒顆粒進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)持有疑問，特別是對如何選擇適合的慢病毒量感到困惑。這個問題可根據(jù)確定細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of Infection, MOI）來解決。

滴度與 MOI？

TU/mL 是目前使用廣泛的慢病毒顆粒滴度單位，「TU」為「Transduction Units」的縮寫，表示可成功轉(zhuǎn)導(dǎo)目的細(xì)胞的基因組數(shù)。

選購慢病毒顆粒之前，首先需了解目的細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)：MOI。MOI 的概念很簡單，可有效感染細(xì)胞的慢病毒顆粒數(shù)與被感染細(xì)胞數(shù)的比值即為該細(xì)胞的 MOI 值。例如，應(yīng)用 106 TU 慢病毒感染 106 個細(xì)胞可成功使 80% 以上細(xì)胞達(dá)到轉(zhuǎn)導(dǎo)目的時，MOI=1；如需要以 5 × 106 TU 病毒才可成功感染 106 個細(xì)胞，則 MOI = 5。（TU/mL 為慢病毒滴度單位，TU 表示有活性的慢病毒量）

如何確定目的細(xì)胞的 MOI 值?

慢病毒對不同類型細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率各不相同，因此 MOI 也各異。在此，我們列出了多種常用細(xì)胞系的 MOI，助您選購合適的慢病毒量。下表是 GeneCopoeia 通過實驗摸索得出的多種細(xì)胞系的 MOI 參考值。

請注意：上表所示的 MOI 值僅供您選購慢病毒時作為用量參考。根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)、操作手法等的差別，實際數(shù)據(jù)可能有輕微浮動。所以當(dāng)您收到所購買的慢病毒時，我們?nèi)匀唤ㄗh您通過設(shè)計梯度 MOI 感染小量細(xì)胞實驗（如：MOI = 0.3, 1, 3, 5, 10, etc.）檢測目的細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，確認(rèn)其 MOI 值。另外，若您的實驗細(xì)胞未被列在上表中，梯度實驗確定最佳 MOI 是至關(guān)重要。您可將病毒進(jìn)行梯度稀釋，分別感染等量的細(xì)胞（見圖 1）。
 

圖 1. 梯度稀釋慢病毒顆粒，摸索細(xì)胞最佳 MOI 值

進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)的 1 天前，于 96 孔板鋪板培養(yǎng)目的細(xì)胞 (實例中使用了 H1299 細(xì)胞)；在進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)當(dāng)天，以 10 倍梯度稀釋慢病毒并分別進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)；轉(zhuǎn)導(dǎo) 72 小時后以熒光顯微鏡觀察 GFP 報告基因表達(dá)情況，確定該細(xì)胞在最佳轉(zhuǎn)導(dǎo)效果下的慢病毒量。

最后，若您的實驗細(xì)胞要求較高的 MOI 值, 您還可通過以下幾種方法將其降低。方法一是加入 polybrene (hexadimethrine bromide), 一種能夠減少病毒與細(xì)胞膜間電荷排斥作用的陽離子聚合物。另一種方法是使用能夠捕獲慢病毒顆粒的磁珠（例如，利用磁珠可成功地將 MM-AN 細(xì)胞的 MOI 從 16 降到 4）。購買或構(gòu)建克隆時，可選擇載體骨架上帶有標(biāo)記基因（如：Puromycin, Neomycin 等）的克隆，可方便后續(xù)進(jìn)行藥物篩選，建立將目的基因成功地隨機整合到特定細(xì)胞的穩(wěn)定細(xì)胞株。

二、慢病毒感染目的細(xì)胞實驗步驟

1. 感染預(yù)實驗

以 24 孔培養(yǎng)板為例，同時進(jìn)行目的細(xì)胞和工具細(xì)胞的感染預(yù)實驗。工具細(xì)胞可選擇 293T（人胚腎上皮細(xì)胞）、H1299（人肺癌細(xì)胞）或其它細(xì)胞。實驗材料：培養(yǎng)基、24 孔培養(yǎng)板，移液槍，槍頭， EP 管，細(xì)胞計數(shù)板、冰盒、廢液缸等。（根據(jù)目的細(xì)胞情況，可酌情使用 Polybrene）

Day1：
準(zhǔn)備細(xì)胞：培養(yǎng)細(xì)胞至對數(shù)生長期，細(xì)胞以胰酶消化計數(shù)后，用細(xì)胞計數(shù)測出細(xì)胞密度，每孔接種 5×104 個細(xì)胞，添加細(xì)胞培養(yǎng)液至 500µL。通常情況下，該接種量的 H1299 或 293T 細(xì)胞在感染后第 3 天可生長至 80%-90% 融合度。（接種目的細(xì)胞時，請根據(jù)細(xì)胞的實際生長速度調(diào)整接種量，使目的細(xì)胞感染后第 3 天生長至 80%-90% 融合度）

Day2：
（1）準(zhǔn)備慢病毒顆粒：計算所需慢病毒顆粒的量，將凍存在 -80℃ 的慢病毒顆粒取出，冰浴融化；
（2）感染目的細(xì)胞：從培養(yǎng)箱中拿出細(xì)胞，置于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)及細(xì)胞融合度；如細(xì)胞狀態(tài)較好，則開始實驗：
A. 用移液槍小心吸去 24 孔板中的舊培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液；
B. 在細(xì)胞中分別加入計算好的慢病毒顆粒液，將培養(yǎng)板平置于工作臺上，以劃 8 字的方式輕柔混勻；
C. 混勻后，細(xì)胞培養(yǎng)板置于 37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)。

Day3：
更換培養(yǎng)液：感染 12-16 小時后，吸出含慢病毒顆粒的培養(yǎng)液，重新向培養(yǎng)板添加含 5% 滅活 FBS（胎牛血清）的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。（目的細(xì)胞需要調(diào)整感染時長，部分細(xì)胞不可感染超過 12 小時。）

Day4：
繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，觀察細(xì)胞狀態(tài)是否有異常。

Day5：
觀察（評估）慢病毒顆粒感染效率：蓋緊 24 孔培養(yǎng)板，使用 70% 乙醇清理培養(yǎng)板外壁，在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，拍照并估計慢病毒顆粒對細(xì)胞的感染效率。（如果慢病毒顆粒攜帶的基因表達(dá)所需的時間較長，熒光表達(dá)所需時間也較長，建議感染 72、96 小時后觀測熒光表達(dá)。）

根據(jù)熒光情況，可以初步從 MOI 梯度摸索實驗中，找出適合目的細(xì)胞的 MOI 值。
 

圖 1. H1299 細(xì)胞的 MOI 梯度摸索結(jié)果示例
 

示例中使用的慢病毒顆粒是 LPP-eGFP-Lv105（滴度 1×10 8TU/mL），曝光時間 1s，顯微倍數(shù) 100×。從上圖可見第 2 組細(xì)胞的感染效率已達(dá)到 90%。由于慢病毒顆粒對細(xì)胞有一定毒性，當(dāng) MOI 值過高時，繼續(xù)添加慢病毒顆粒，感染效率沒有明顯增加，且細(xì)胞狀態(tài)容易變差、皺縮甚至死亡。

熒光報告基因和目的基因的相對表達(dá)并不總是成等比關(guān)系的。在有的情況下，即使熒光報告基因表達(dá)較低或無表達(dá)，目的基因依然能夠表達(dá)；反之亦然。所以在觀察熒光效果后，建議使用 qRT-PCR 作進(jìn)一步鑒定。
 

圖 2. 293T 細(xì)胞的 MOI 梯度摸索結(jié)果示例
 

示例中使用的慢病毒顆粒是 LPP-eGFP-Lv105（滴度 1×108TU/mL），曝光時間 0.6s，顯微倍數(shù) 100×。從上圖可見第 2 組細(xì)胞的感染效率已達(dá)到 80%。由于慢病毒顆粒對細(xì)胞有一定毒性，當(dāng) MOI 值過高時，繼續(xù)添加慢病毒顆粒，感染效率沒有明顯增加，且細(xì)胞狀態(tài)容易變差、皺縮甚至死亡。

2. 摸索細(xì)胞的最適藥物篩選濃度

細(xì)胞的種類與狀態(tài)均會影響慢病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，部分細(xì)胞可能與慢病毒顆粒有相互抵抗的現(xiàn)象，導(dǎo)致感染效率低。當(dāng)您在感染后 72、96 小時后發(fā)現(xiàn)感染效果仍不理想，建議對感染后的細(xì)胞進(jìn)行藥物篩選（藥篩），以收集較多感染成功的細(xì)胞。

慢病毒顆粒攜帶的基因整合到目的細(xì)胞基因組是隨機發(fā)生的非同源性重組，當(dāng)抗性基因表達(dá)時，目的基因不一定也能表達(dá)，在進(jìn)行藥篩處理后，還要以 qRT-PCR 作進(jìn)一步鑒定。

在進(jìn)行正式的抗生素篩選前，建議您先對空白細(xì)胞的最小致死濃度進(jìn)行摸索、優(yōu)化。
 

表 4. 抗生素篩選細(xì)胞的相關(guān)參考值

以 293T 細(xì)胞+Puromycin 為例，從相關(guān)文獻(xiàn)查得 Puromycin 對 293T 細(xì)胞的最小致死濃度為 2 µg/mL。在 2 µg/mL 附件多設(shè)置幾個濃度梯度，可以得出較精確的的篩選濃度。

（1）準(zhǔn)備 24 孔培養(yǎng)板，按每孔 1-5×104 細(xì)胞數(shù) (約等于 20%-35% 融合度) 接種 293T 空白細(xì)胞，對其中 6 個孔進(jìn)行鋪板；

（2）一般 Puromycin 母液的濃度是 10 mg/mL，用細(xì)胞培養(yǎng)基將 Puromycin 母液稀釋 1000 倍，可獲得終濃度為 10 µg/mL 的 Puromycin 稀釋液；

（3）按表 5 所示，每孔添加相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基和 Puromycin；

（4）24 孔培養(yǎng)板置于 37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱，培養(yǎng)過夜；

（5）按表 4 的藥篩時間和觀察時間建議，定期在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。
當(dāng)空白細(xì)胞剛好能全部死亡時，該濃度的抗生素可作為最適藥篩濃度。
 

表 5. 藥物篩選濃度梯度參考（Puromycin）

 

* 表格中使用的 Puromycin 濃度為 10 µg/mL，是由 10 mg/mL 的 Puromycin 母液以細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋 1000 倍所得。

注：以上表格的設(shè)置僅供參考。通常即使細(xì)胞一樣，由于培養(yǎng)的條件和傳代次數(shù)不一樣，篩選濃度亦不一樣。可根據(jù)試驗結(jié)果進(jìn)行更進(jìn)一步的細(xì)化濃度梯度設(shè)置。 如果藥篩過程中細(xì)胞量較少，為保持細(xì)胞的數(shù)一定，一般不換液，只有在穩(wěn)轉(zhuǎn)株藥篩過程中，根據(jù)細(xì)胞生長速度，3-4 天換液一次。

如果目的細(xì)胞較難感染，一次感染不能達(dá)到預(yù)期效果時，在感染 3 天后可對目的細(xì)胞進(jìn)行藥篩處理，獲得較多被感染的細(xì)胞，如以下例子所示：
 

圖 3. 人食管癌細(xì)胞 CE-81T（貼壁細(xì)胞）的藥篩前后效果對比
 

圖 4. 人骨肉瘤細(xì)胞 Hos（貼壁細(xì)胞）的藥篩前后效果對比
 

圖 5. 人白血病 K562（懸浮細(xì)胞）的藥篩前后效果對比
 

圖 6. 293T 細(xì)胞在不同融合度的明視野效果（放大倍數(shù)：100×）

3. 實驗體系的放大和正式實驗；

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，放大慢病毒顆粒細(xì)胞感染實驗，實施正式實驗。

通過慢病毒顆粒感染細(xì)胞的預(yù)實驗，我們大致獲得慢病毒顆粒感染目的細(xì)胞的優(yōu)化條件。正式實驗所用的細(xì)胞數(shù)往往比預(yù)實驗多，慢病毒顆粒用量也需要適當(dāng)放大。放大原則是保持細(xì)胞密度一致，按實際細(xì)胞數(shù)與預(yù)實驗細(xì)胞數(shù)的比例放大培養(yǎng)液體積和慢病毒顆粒用量。有兩種放大方法可供參考：

按底面積放大（適用于貼壁細(xì)胞）
當(dāng)細(xì)胞的密度不變時，細(xì)胞總數(shù)和底面積成正比，且 MOI 不變，所需慢病毒顆粒用量也和底面積成正比。假設(shè)預(yù)實驗使用 96 孔板（底面積 0.3 cm2），使用 1 μL 慢病毒顆粒（滴度 1×108 TU/mL）可成功感染細(xì)胞；如正式實驗使用 6 孔板（底面積 10 cm2），則：
底面積的放大倍數(shù) ≈ 33
正式的慢病毒顆粒用量 = 預(yù)實驗用量×33 = 33 μL 慢病毒顆粒（滴度 1×108 TU/mL）
注：請確保細(xì)胞均勻、單層分布，不成簇生長。

按培養(yǎng)體積放大（適用于懸浮細(xì)胞）
當(dāng)細(xì)胞的密度不變時，細(xì)胞總數(shù)和感染體積成正比，且 MOI 不變，所需慢病毒顆粒用量也和培養(yǎng)液體積成正比。假設(shè)預(yù)實驗使用 96 孔板（培養(yǎng)體積 100μL），使用 1 μL 慢病毒（滴度 1×108 TU/mL）可成功感染細(xì)胞；如正式實驗使用 6 孔板（培養(yǎng)體積 2 mL），則：
培養(yǎng)體積的放大倍數(shù) = 20
正式的慢病毒顆粒用量 = 預(yù)實驗用量×20 = 20 μL 慢病毒顆粒（滴度 1×108 TU/mL）
注：請確保細(xì)胞生長狀態(tài)良好。

三、使用慢病毒的常見問題

1. 怎樣購買份量合適數(shù)量的慢病毒顆粒？

一套完整實驗所需的慢病毒顆粒包括：1. 含有目的基因的慢病毒顆粒，2. 陰性對照慢病毒顆粒，3. 用于預(yù)實驗的陽性對照慢病毒顆粒。

購買時可以根據(jù)目的細(xì)胞特性、檢測方法、培養(yǎng)器皿估算慢病毒顆粒的最佳用量，避免剩余的大量慢病毒顆粒超出最佳保存期；此外，GeneCopoeiaTM 同時提供高滴度低價格的陽性對照慢病毒顆粒，幫助您以較低的預(yù)算和較充足的材料完成預(yù)實驗的條件探索。初次使用慢病毒顆粒的研究者也可使用陽性對照慢病毒顆粒熟悉實驗過程。

2. 慢病毒顆粒可以用于動物體內(nèi)（In vivo）實驗嗎？

GeneCopoeiaTM 提供的即用型慢病毒顆粒全部經(jīng)過純化、濃縮處理，去除了細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，進(jìn)一步降低免疫原性，適用于各類活體動物注射實驗和成瘤實驗。

3. 慢病毒顆粒對目的細(xì)胞的感染效率很低，如何提高感染效率？

提高感染效率的前提是保證細(xì)胞生長狀態(tài)良好。其次，可以通過提高 MOI 值來提高感染效率，也可以在培養(yǎng)基中加入 Polybrene (4-10 µg/mL) 提高感染效率。

4. 添加慢病毒顆粒后，細(xì)胞為什么大量死亡?

慢病毒顆粒對靶細(xì)胞有一定毒性。添加量過多、感染時間過長都可能對目的細(xì)胞 造成傷害。如遇上這種情況，建議您降低 MOI 值，并在感染細(xì)胞 4-8 小時后進(jìn)行換 液（以新鮮的全培養(yǎng)基替換含慢病毒顆粒的舊培養(yǎng)基），最長換液時間不可大于 12 小時。

5.Polybrene 是什么？在慢病毒顆粒感染中，Polybrene 添加越多越好嗎？

Polybrene 是常用的感染添加劑，通常的使用濃度為 4-10 µg/mL，Polybrene 能 顯著提高慢病毒的感染效率，通常能提高感染效率 2-10 倍，對部分細(xì)胞甚至可 提高感染效率 10-20 倍。當(dāng)目的細(xì)胞 MOI 高于 20 時，我們建議在培養(yǎng)基中加入 Ploybrene(約 4-10 µg/mL) 適當(dāng)提高感染效率。

然而，Polybrene 有一定的細(xì)胞毒性，不同細(xì)胞對 Polybrene 的敏感度和耐受性不同，部分細(xì)胞對 Polybrene 反應(yīng)明顯，容易導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差、形態(tài)發(fā)生變化、甚至死亡，因此并非每種細(xì)胞都適合添加 Polybrene。

在正式使用 Polybrene 前，建議在 1-10 µg/mL 范圍內(nèi)設(shè)置梯度，觀察細(xì)胞在該濃度下，24 小時后是否仍保持健康生長，從而確定該細(xì)胞的最適 Polybrene 濃度。

6. 目的細(xì)胞可以被慢病毒顆粒感染，但 eGFP 的熒光強度很低，為什么？

在目的細(xì)胞被慢病毒顆粒感染過程中，eGFP 熒光強度取決于病毒感染細(xì)胞內(nèi)的慢病毒顆粒數(shù)、細(xì)胞本身的狀態(tài)、細(xì)胞類型以及觀察時間等。一般情況下，目的細(xì)胞感染慢病毒顆粒數(shù)越多，細(xì)胞增殖越快，eGFP 熒光會較強。慢病毒攜帶基因表達(dá)時間較長，一般在增殖較快的細(xì)胞中也需要感染 72-96 小時才會到達(dá) eGFP 的表達(dá)高峰。對于增殖較慢的細(xì)胞，感染時間則需更長。建議如果您的細(xì)胞在感染后觀察的熒光強度較低，建議繼續(xù)培養(yǎng)一段時間再觀察。

7. 進(jìn)行慢病毒顆粒感染后，為什么目的細(xì)胞用 qPCR 檢測不到目的基因表達(dá)量的變化？

如果使用的檢測方法是 qPCR，原因可能是目的基因含特殊序列結(jié)構(gòu)、或與目的細(xì)胞系統(tǒng)不能兼容的問題，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄受影響，建議同時培養(yǎng)、感染目的細(xì)胞和 293T 工具細(xì)胞，同時進(jìn)行檢測，如目的基因在 293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄不受影響，則可能為目的基因與目的細(xì)胞的相互作用導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄受阻。

8. 慢病毒顆粒在儲存期間不慎染菌，還可以繼續(xù)使用嗎？

如慢病毒顆粒不慎染菌，且實驗材料有限，可以使用 0.45 µm 濾膜對慢病毒進(jìn)行濾菌操作。當(dāng)然，該操作會導(dǎo)致一定程度的滴度損失及慢病毒顆粒總量損失。如條件允許，建議重新購買該種慢病毒。