細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)問(wèn)題及其解決方法
 
1.如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？ 
培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒(méi)有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng)。總之，MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開(kāi)始。 
2. 何時(shí)須更換培養(yǎng)基？ 
視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定， 或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。  
3. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？ 
不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng)， 造成細(xì)胞無(wú)法存活。 
4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？ 
不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清， 在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活。  
5 何謂FBS, FCS, CS, HS ?  
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯(cuò)誤的使用字眼， 請(qǐng)不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。  
6 培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5 % 或10% CO2？或根本沒(méi)有影響？  
一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)， 而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10 % CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時(shí)， 則應(yīng)使用5 % CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。 
7.Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)和Earle’s平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別？  
HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會(huì)變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織，用Hanks液就可以了。 
8. 細(xì)胞之接種密度為何？  
依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)之一重要原因。
9. 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？  
一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中， 稀釋細(xì)胞濃度即可， 若培養(yǎng)液太多時(shí)， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高， 直到無(wú)法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶， 加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度， 重復(fù)前述步驟即可。 
10.冷凍管應(yīng)如何解凍？  
取出冷凍管后， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化， 并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)， 必須注意安全， 預(yù)防冷凍管之爆裂。 
11. 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)， 是否應(yīng)馬上去除DMSO？  
除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO 敏感之細(xì)胞外， 絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞）， 在解凍之后， 應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附之問(wèn)題。 
12. 附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用之trypsin-EDTA 濃度？應(yīng)如何處理？  
一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中， 保存于–20 °C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機(jī)會(huì)。  
13.欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái)，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？  
欲回收動(dòng)物細(xì)胞， 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘， 過(guò)高之轉(zhuǎn)速， 將造成細(xì)胞死亡。  
14. 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？  
動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中， 必須使用前先行配制完成。  
15.DMSO 之等級(jí)和無(wú)菌過(guò)濾之方式為何？  
冷凍保存使用之DMSO 等級(jí)， 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即為無(wú)菌狀況， 第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中， 保存于4°C， 避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)， 并可減少污染之機(jī)會(huì)。若要過(guò)濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質(zhì)濾膜。  
16.冷凍保存細(xì)胞之方法？  
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。 
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。*-20 °C 不可超過(guò)1 小時(shí)， 以防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。  
17. 細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)， 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？  
冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細(xì)胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。
18.培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？  
除于特殊篩選系統(tǒng)中外， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下， 培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。 
19.應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？  
細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)基配制是減低污染較好方法。  
20.如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí)，應(yīng)如何處理？  
原則上：直接滅菌后丟棄之。  
當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時(shí)，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開(kāi)，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái)，檢查HEPA過(guò)濾器。 
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂(lè)菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。 
1.在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。 
2.分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。 
3.每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。 
4.確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2～3代。 
5.在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。 
6.重復(fù)步驟4。 
7.在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6代，確定污染是否以已被消除。 
21.支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？  
不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株， 無(wú)法以其外觀分辨之。  
22.支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？  
支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長(zhǎng)參數(shù)， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。 
23. 偵測(cè)出細(xì)胞株有支原體污染時(shí)， 該如何處理？  
直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株。
24. CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？  
定期(至少每?jī)芍芤淮? 以無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水更換之。  
25.為何培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中， 顏色會(huì)偏暗紅色， 且pH值會(huì)越來(lái)越偏堿性？  
培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中， 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來(lái)越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)， 可以通入無(wú)菌過(guò)濾之CO2， 以調(diào)整pH 值。  
26. 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？  
不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對(duì)大部分細(xì)胞沒(méi)有太大之影響， 惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長(zhǎng)差異。 
27. 購(gòu)買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？  
研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少， 大都是因?yàn)殡x心過(guò)程操作上的失誤， 造成細(xì)胞的物理性損傷， 以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心， 應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。  
28.購(gòu)買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？  
研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳， 常見(jiàn)原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過(guò)程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后， 加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于–80 °C 太久。  
29. 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？  
冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí)，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。  
30.L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？  
L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)降解，但是確切的降解率一直沒(méi)有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。zzzzzz 
31.GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？  
GlutaMAX-I 二肽是一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來(lái)保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。 
GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎降解。 
32.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？  
酚紅在培養(yǎng)基中用作PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。 
33.如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞？  
用無(wú)血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200～2000個(gè)/毫升，在0.1毫升細(xì)胞懸液中加0.1毫升0.4％的臺(tái)盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。活細(xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，因而染成藍(lán)色細(xì)胞是死細(xì)胞。 
34.培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？  
丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒(méi)有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。 
35.二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么？  
二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來(lái)螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來(lái)自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。 
36.室溫下配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用時(shí)PH值是多少？  
緩沖液PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時(shí)，不同PH值。 
50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時(shí)，不同PH值 
4°C 
25°C 
37°C 
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5
8.6
8.7
8.8
8.9
9.0
9.1
9.2
9.3
9.4
8.5
7.6
7.7
7.8
7.9
8.0
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5
8.6
8.7
8.8
7.2
7.3
7.4
7.5
7.6
7.7
7.8
7.9
8.0
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5

37.如何從T25瓶中轉(zhuǎn)移sf9細(xì)胞？能用胰蛋白酶消化嗎？ 
我們推薦使用脫落細(xì)胞的方法，此技術(shù)破壞性最小，生活力最高。通過(guò)使用巴斯德吸液管，讓細(xì)胞上培養(yǎng)基流動(dòng)。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。只有在絕對(duì)必要的情況下，才使用胰酶消化細(xì)胞。 
38.胰酶消化一個(gè)T25瓶的sf9細(xì)胞： 
1. 去除培養(yǎng)基。 
2. 用2ml 1xPBS（足以覆蓋細(xì)胞表面）洗滌細(xì)胞，去除PBS。 
3. 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆蓋細(xì)胞表面）。 
4. 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測(cè)看到5分鐘后它們正在向上移動(dòng)。 
5. 向細(xì)胞中加入2ml 細(xì)胞培養(yǎng)液，移入錐形管，用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養(yǎng)基中的FBS終止了胰酶的活性。） 
6. 離心（1100rpm）沉淀細(xì)胞。去除培養(yǎng)基。 
7. 用新的培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。傳代。 
39.在Sf9, Sf21, 和high Five細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)，肝素的使用量是多少？ 
為了防止懸浮培養(yǎng)細(xì)胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細(xì)胞懸液。 
40.在重新凍存sf9細(xì)胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數(shù)的增加，它的感染能力會(huì)降低嗎？ 
通常情況當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)30次傳代后，應(yīng)該返回凍存。無(wú)論什么時(shí)候計(jì)數(shù)時(shí)，都應(yīng)該檢查細(xì)胞活力。如果超過(guò)95％的細(xì)胞保持有活力和在大約30小時(shí)左右加倍，細(xì)胞仍然可以使用。如果活力和加倍時(shí)間下降，它們的感染力將不在是有效的。 
41.貯存在冰箱中的瓶口已開(kāi)的培養(yǎng)基，在放置幾天后顏色變紫? 
這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時(shí)，碳酸氫納導(dǎo)致了pH值的上升。您可以在使用前松開(kāi)瓶口，在CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)基10-15分鐘，來(lái)校正溶液的pH值（確定松開(kāi)瓶口以保證氣體交換）。 
42. 細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍，可否繼續(xù)使用？ 
如果細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍，您應(yīng)該熔化培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒(méi)有沉淀產(chǎn)生，培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基。 
43. 無(wú)血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)使用的抗生素量一樣嗎？ 
當(dāng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí)，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會(huì)結(jié)合和滅活一些抗生素。在無(wú)血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對(duì)于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。
44. 培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長(zhǎng)期保存嗎？ 
一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_(kāi)始降解。 
45.培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復(fù)凍融嗎？ 
大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會(huì)在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會(huì)影響它的性能。 
46.為什么要在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液? 
胰蛋白酶在4℃就可能開(kāi)始降解，如果在室溫下放置超過(guò)30分鐘，就會(huì)變得不穩(wěn)定。 
47.保存血清較好的方法? 
我們建議血清應(yīng)保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃時(shí)，請(qǐng)勿超過(guò)一個(gè)月。若一次無(wú)法用完一瓶，建議無(wú)菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。 
48. 如何解凍血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損? 
將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過(guò)程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。 
49. 血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理? 
血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會(huì)存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。 
若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無(wú)菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過(guò)濾。最好不使用過(guò)濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因?yàn)樗赡軙?huì)阻塞過(guò)濾膜。
50. 為什么要熱滅活血清? 
加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng)ES細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。 
51. 有必要做熱滅活嗎? 
實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過(guò)正確處理的熱滅活血清，對(duì)大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過(guò)的血清對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)只有微小的促進(jìn)，或沒(méi)有任何作用，甚至通常因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量，而造成細(xì)胞生長(zhǎng)速率的降低。而經(jīng)過(guò)熱處理的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點(diǎn)"，常常會(huì)讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中，又會(huì)使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增。 
若非必須，可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時(shí)間，更確保血清的質(zhì)量! 
52. 為什么儲(chǔ)存在冰箱中的胎牛血清會(huì)出現(xiàn)沉淀? 
有些胎牛血清產(chǎn)品沒(méi)有預(yù)老化，儲(chǔ)存在2－8℃時(shí)，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見(jiàn)的混濁。這應(yīng)該不會(huì)影響血清的質(zhì)量。推薦在－20℃儲(chǔ)存胎牛血清，避免反復(fù)凍融。 
53. 如何避免沉淀物的產(chǎn)生? 
我們建議您在使用血清的時(shí)候，注意下列的操作: 
(1)解凍血清時(shí)，請(qǐng)按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時(shí)改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，非常容易產(chǎn)生沉淀物。 
(2)解凍血清時(shí)，請(qǐng)隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。 
(3)請(qǐng)勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會(huì)因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。 
(4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無(wú)須做此步驟。 
(5)若必須做血清的熱滅活，請(qǐng)遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過(guò)高，時(shí)間過(guò)久或搖晃不均勻，都會(huì)造成沉淀物的增多。
                            細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)問(wèn)題解答(FAQ)
1 冷凍管應(yīng)如何解凍？ 
取出冷凍管后， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化， 并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)， 必須注意安全， 預(yù)防冷凍管之爆裂。 
2 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)， 是否應(yīng)馬上去除DMSO？ 
除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO 敏感之細(xì)胞外， 絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞）， 在解凍之后， 應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附之問(wèn)題。 
3 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？ 
不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng)， 造成細(xì)胞無(wú)法存活。 
4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？ 
不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源， 所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清， 在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活。 
5 何謂FBS, FCS, CS, HS ? 
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯(cuò)誤的使用字眼， 請(qǐng)不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。 
6 培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5 % 或10% CO2？或根本沒(méi)有影響？ 
一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)， 而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10 % CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時(shí)， 則應(yīng)使用5 % CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。 
7 何時(shí)須更換培養(yǎng)基？ 
視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定， 或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。 
8 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？ 除于特殊篩選系統(tǒng)中外， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下， 培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。 
9 附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用之trypsin-EDTA 濃度？應(yīng)如何處理？ 
一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中， 保存于–20 °C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機(jī)會(huì)。 
10 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？ 
一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中， 稀釋細(xì)胞濃度即可， 若培養(yǎng)液太多時(shí)， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高， 直到無(wú)法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶， 加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度， 重復(fù)前述步驟即可。 
11 欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái)，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？ 
欲回收動(dòng)物細(xì)胞， 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘， 過(guò)高之轉(zhuǎn)速， 將造成細(xì)胞死亡。 
12 細(xì)胞之接種密度為何？ 
依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)之一重要原因。 
13 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？ 
動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中， 必須使用前先行配制完成。 
14 DMSO 之等級(jí)和無(wú)菌過(guò)濾之方式為何？ 
冷凍保存使用之DMSO 等級(jí)， 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即為無(wú)菌狀況， 第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中， 保存于4°C， 避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)， 并可減少污染之機(jī)會(huì)。若要過(guò)濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質(zhì)濾膜。 
15 冷凍保存細(xì)胞之方法？ 
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。 
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。*-20 °C 不可超過(guò)1 小時(shí)， 以防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微 
降低一些。 
16 細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)， 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？ 
冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細(xì)胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。 
17 應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？ 
細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)基配制是減低污染好方法。 
18 如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí)，應(yīng)如何處理？ 
直接滅菌后丟棄之。
19 支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？ 
不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株， 
無(wú)法以其外觀分辨之。 
20 支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？ 
支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長(zhǎng)參數(shù)， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。 
21 偵測(cè)出細(xì)胞株有支原體污染時(shí)， 該如何處理？ 
直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株。 
22 CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？ 
定期(至少每?jī)芍芤淮? 以無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水更換之。 
23 為何培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中， 顏色會(huì)偏暗紅色， 且pH值會(huì)越來(lái)越偏堿性？ 
培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中， 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來(lái)越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)， 可以通入無(wú)菌過(guò)濾之CO2， 以調(diào)整pH 值。 
24 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？ 
不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對(duì)大部分細(xì)胞沒(méi)有太大之影響， 惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長(zhǎng)差異。 
25 購(gòu)買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？ 
研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少， 大都是因?yàn)殡x心過(guò)程操作上的失誤， 造成細(xì)胞的物理性損傷， 以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心， 應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。 
26 購(gòu)買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？ 
研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳， 常見(jiàn)原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過(guò)程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后， 加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于–80 °C 太久。 
27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？ 
冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí)，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。
細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)問(wèn)題及解答 
1.如何選用培養(yǎng)基？
    培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒(méi)有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng)。總之，MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，各種目的無(wú)血清培養(yǎng)的是AIM V培養(yǎng)基（SFM）。 
2.為什么要熱滅活血清？
    加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在進(jìn)行免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。 
3.L－谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？ 
    L－谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L－谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L－谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)降解，但是確切的降解率一直沒(méi)有最終確定。L－谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。
4.GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？ 
    GlutaMAX-I二肽是L－谷氨酰胺的衍生物，將其不穩(wěn)定的α－氨基用L－丙氨酸來(lái)保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L－谷氨酰胺供利用。
    GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L－谷氨酰胺幾乎降解。
5.為什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？ 
    酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。
6.如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞？ 
    用無(wú)血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200－2000個(gè)/毫升，在0.1毫升的細(xì)胞中加入0.1毫升的0.4％的臺(tái)盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。活細(xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞。
7.如何消除組織培養(yǎng)的污染？
    當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時(shí)，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開(kāi)，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái)，檢查HEPA過(guò)濾器。
    高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂(lè)菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。
1)在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。
2)分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3)每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。
4)確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2－3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2－3代。
5)在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。
6)重復(fù)步驟4。
7)在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4－6代，確定污染是否以已被消除。
8.培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？
    丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源。盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒(méi)有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。
9.Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）和Earle’s平衡鹽溶液（EBS）有什么本質(zhì)的功能差別？ 
    HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，碳酸氫鈉的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會(huì)變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織，用Hanks液就可以了。
10.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差別?
    Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清執(zhí)行的所有的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)程序，而且除了這些標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)，Certified胎牛血清還有如下一些附加的檢測(cè)：
End-Point Determination of Endotoxin Content
噬菌體檢驗(yàn)
生物化學(xué)檢測(cè) 
激素的檢測(cè)
血紅蛋白檢測(cè)
Sf9 細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)及方法學(xué)檢測(cè)
11.二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么？ 
    二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來(lái)螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來(lái)自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。
12.制備 lipid-DNA的方法會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率嗎？ 
    是的。對(duì)于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀釋試劑在100μl OPTI-MEM中，稀釋DNA在100μl OPTI-MEM中。混合兩種溶液在室溫下孵育15分鐘。對(duì)于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允許稀釋的試劑和培養(yǎng)基孵育至少30分鐘可以增加3倍的效率。確保復(fù)合物在沒(méi)有血清的情況下形成。孵育15分鐘后，在復(fù)合物中加入含有血清的培養(yǎng)基（800μl）。（注意以上是35mm培養(yǎng)皿使用體積）。對(duì)于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA應(yīng)該在與脂質(zhì)體混合之前首先與Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步驟允許在一個(gè)很小的體積下混合DNA和脂質(zhì)體，接下來(lái)可以不需要換培養(yǎng)基的情況下直接加入。
13.我使用SF900 Ⅱ時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，但是為什么我的蛋白產(chǎn)物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時(shí)效果好？ 
    如果目的蛋白是一個(gè)后期蛋白，它將與蛋白酶一起表達(dá)，這些蛋白酶將會(huì)作用于目的蛋白。在加有血清的培養(yǎng)基中，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白，從而使目的蛋白產(chǎn)品保持完好。在無(wú)血清配方中，蛋白酶作用的底物是你的目的蛋白。為了避免這一問(wèn)題，加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清（少于1％），讓血清給蛋白酶提供作用底物。 
14.如何檢測(cè)內(nèi)毒素(熱源)水平？ 
    LAL（Limulus Amebocyte Lysate）試驗(yàn)是可用的最敏感和特異的檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的方法。Levin和Bang 發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可引起鱟（Limulus polyphemus）血管內(nèi)的凝集作用。內(nèi)毒素啟動(dòng)一個(gè)細(xì)胞內(nèi)酶原系統(tǒng)（絲氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)），通過(guò)修飾凝集素，產(chǎn)生一種透明的膠，LAL中的凝固蛋白，從而，形成不可溶的基質(zhì)。LAL試劑緩沖的鱟（血細(xì)胞）裂解物。
胎牛血清的內(nèi)毒素檢測(cè)是在Grand Island，按照手冊(cè)上Gel-clot 方法進(jìn)行的。在對(duì)血清產(chǎn)品進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)前，用無(wú)熱源的水1：10稀釋樣品。稀釋樣品沸水育5分鐘，以消除抑制劑。（通常，血液中的內(nèi)毒素結(jié)合成份的出現(xiàn)會(huì)抑制凝膠過(guò)程，使內(nèi)毒素不能與LAL反應(yīng)。樣品預(yù)先熱處理可以消除這種抑制作用。） 
15.我可以使用固體形式的Murashige Skog 培養(yǎng)基嗎？ 
    如果使用固體形式的培養(yǎng)基，需要加入瓊脂。瓊脂加入前要先滅菌。應(yīng)該避免MS培養(yǎng)基的直接滅菌，應(yīng)該高壓滅菌瓊脂溶液，然后把融化的瓊脂溶液加入到MS培養(yǎng)基中。
16. 20℃下配制的緩沖液，在較高或較低的溫度下PH值會(huì)改變嗎？
    對(duì)于普通使用的緩沖液，PH值隨溫度變化而變化。
下表列出溫度改變10℃時(shí)，PH值的變化情況
例如 20℃下配制PH7.4 Tris緩沖液,40℃時(shí)PH值為 7.4-（2x0.310）＝6.78
17. 室溫下(25℃)配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用時(shí)PH值是多少？
    緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時(shí)，不同的PH值。
18. 昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)的最適PH值和滲透壓是多少？
    生長(zhǎng)培養(yǎng)基的PH值對(duì)細(xì)胞的增值和病毒或重組蛋白的生產(chǎn)均會(huì)產(chǎn)生影響。對(duì)于大部分鱗翅類昆蟲(chóng)細(xì)胞系，在PH值 6.0－6.4范圍的大部分應(yīng)用效果良好。培養(yǎng)鱗翅類昆蟲(chóng)細(xì)胞系時(shí)，培養(yǎng)基的最適滲透壓是 345－380mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細(xì)胞培養(yǎng)方式，減少技術(shù)問(wèn)題，保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內(nèi)。
19. High Five細(xì)胞有任何其它名稱嗎？
    High Five細(xì)胞也被稱為Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。
20.在High Five無(wú)血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度是多少？ 
    High Five無(wú)血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。 
21.High Five細(xì)胞用多大的密度凍存？ 
    3.0x10E6 cells/ml 
22.在我的果蠅培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)形成白色沉淀，加熱后溶解。它是什么？對(duì)我的細(xì)胞有害嗎？ 
    可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培養(yǎng)基中谷氨酰胺的濃度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的濃度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復(fù)合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養(yǎng)條件下可以溶解，對(duì)實(shí)驗(yàn)不會(huì)有不利的影響。 
23.如何從T25瓶中轉(zhuǎn)移sf9細(xì)胞？能用胰蛋白酶消化嗎？ 
    我們強(qiáng)力推薦使用脫落細(xì)胞的方法，因?yàn)檫@項(xiàng)技術(shù)破壞性最小，生活力最高。通過(guò)使用巴氏德吸液管，讓細(xì)胞上培養(yǎng)基流動(dòng)。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。只有在絕對(duì)必要的情況下，才使用胰酶消化細(xì)胞。
胰酶消化一個(gè)T25瓶的sf9細(xì)胞：
1)去除培養(yǎng)基。
2) 用2ml 1xPBS（足以覆蓋細(xì)胞表面）洗滌細(xì)胞，去除PBS.
3) 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆蓋細(xì)胞表面）。
4) 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測(cè)看到5分鐘后它們正在向上移動(dòng)。
5) 向細(xì)胞中加入2ml 細(xì)胞培養(yǎng)液，移入錐形管，用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養(yǎng)基中的FBS終止了胰酶的活性。）
6) 離心（1100rpm）沉淀細(xì)胞。去除培養(yǎng)基。
7) 用新的培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。傳代。 
24.在Sf9, Sf21, 和high Five細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)，肝素的使用量是多少？ 
    為了防止懸浮培養(yǎng)細(xì)胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細(xì)胞懸液。 
25.如何評(píng)估ES細(xì)胞合格的胎牛血清？ 
    使用D3 ES細(xì)胞。這是一個(gè)對(duì)于胎牛血清中生長(zhǎng)促進(jìn)、生長(zhǎng)抑制和分化因子非常敏感的細(xì)胞系。
相關(guān)生長(zhǎng)效率分析：
    當(dāng)ES細(xì)胞以非常低的密度傳入包含10％胎牛血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，檢測(cè)開(kāi)始和支持ES細(xì)胞克隆的能力。
細(xì)胞毒分析：
    當(dāng)以非常低的密度傳入包含30％胎牛血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，檢測(cè)ES細(xì)胞和feeder細(xì)胞的生長(zhǎng)能力。
相關(guān)形態(tài)學(xué)和分化分析：
    檢測(cè)胎牛血清支持未分化ES細(xì)胞克隆的能力。通過(guò)堿性磷酸酶活性評(píng)估分化程度。未分化的ES細(xì)胞小顏色深紅，分化的細(xì)胞較大，豐滿，顏色較淺。
    所有的分析在沒(méi)有ESGRO的情況下進(jìn)行的，培養(yǎng)基中出現(xiàn)ESGRO會(huì)掩蓋由胎牛血清所導(dǎo)致的問(wèn)題。（ESGRO或LIF經(jīng)常用來(lái)保持ES細(xì)胞處于未分化狀態(tài)。）
    經(jīng)過(guò)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，大約8批中有1批可以用來(lái)培養(yǎng)ES細(xì)胞。
26.在重新凍存sf9細(xì)胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數(shù)的增加，它的感染能力會(huì)降低嗎？ 
    通常情況當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)30次傳代后，應(yīng)該返回凍存。無(wú)論什么時(shí)候記數(shù)時(shí)，都應(yīng)該檢查細(xì)胞活力。如果超過(guò)95％的細(xì)胞保持有活力和在大約30小時(shí)左右加倍，細(xì)胞仍然可以使用。如果活力和加倍時(shí)間下降，它們的感染力將不在是有效的。