名稱pCR-BluntII-TOPO-WNT3A(human)

別稱BC103921.1

基因長1158bp

質(zhì)粒宿主大腸桿菌

質(zhì)粒用途基因模板

片段類型cDNA

片段物種人

原核抗性Kan

篩選標(biāo)記

熒光標(biāo)記

啟動子

復(fù)制子pUC

感受態(tài)DH5a

溫度37度

背景載體

正向引物M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

反向引物M13R：CAGGAAACAGCTATGACC

拷貝數(shù)

產(chǎn)品規(guī)格：0.5ug質(zhì)粒干粉
       收到產(chǎn)品后，請先根據(jù)產(chǎn)品管壁標(biāo)簽來判斷產(chǎn)品形式，并在擴(kuò)增前準(zhǔn)確查找該質(zhì)粒菌株的抗性、感受態(tài)和培養(yǎng)溫度。
pCR-BluntII-TOPO-WNT3A(human)質(zhì)粒擴(kuò)增流程
收到產(chǎn)品后，請先根據(jù)產(chǎn)品管壁標(biāo)簽來判斷產(chǎn)品形式，并在擴(kuò)增前準(zhǔn)確查找該質(zhì)粒菌株的抗性、感受態(tài)和培養(yǎng)溫度。
1、質(zhì)粒干粉（常溫運(yùn)輸，存于-20度，90天保質(zhì)期，請務(wù)必轉(zhuǎn)化挑單克隆培養(yǎng)，不要直接使用和測序）
①收到質(zhì)粒干粉后請先5000rpm離心1min，再加入20μl ddH2O去離子水溶解質(zhì)粒；
②取1支100μl 感受態(tài)于冰上解凍10min，加入2μl質(zhì)粒，再冰浴30min后，42℃熱激60s，不要攪動，再冰浴2min；（從第二步開始均要在超凈工作臺中無菌操作）
③加入900μl無抗的LB液體培養(yǎng)基，180rpm震蕩37℃培養(yǎng)45min；
④6000rpm離心5min，僅留100μl上清液重懸細(xì)菌沉淀，并涂布至目標(biāo)質(zhì)?？剐缘腖B平板上；（可使用本平臺的平板涂布專用玻璃珠進(jìn)行涂布，可以比傳統(tǒng)涂布方法獲得更多轉(zhuǎn)化子）
⑤將平板正向培養(yǎng)1h，再倒置37℃培養(yǎng)14h。如果要求是30度則培養(yǎng)20h，（菌落過多則將質(zhì)粒稀釋后再轉(zhuǎn)化。沒有菌落則加入10μl質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。另不要直接轉(zhuǎn)表達(dá)感受態(tài)，要先轉(zhuǎn)克隆感受態(tài)，重提質(zhì)粒后再導(dǎo)入表達(dá)感受態(tài)）
⑥挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，加入對應(yīng)抗生素，220rpm震蕩培養(yǎng)14h，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要和質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒。
2、甘油菌種（冰袋運(yùn)輸，存于-80℃，保質(zhì)期90天，請務(wù)必劃線挑單克隆培養(yǎng)）四區(qū)劃線后挑單菌落培養(yǎng)，酵母菌需要先液體復(fù)蘇再四區(qū)劃線，再挑單菌落液體培養(yǎng)。
3、穿刺菌種（冰袋運(yùn)輸，存于4℃，保質(zhì)期7天）穿刺接種，液體培養(yǎng)后四區(qū)劃線，再挑單菌落液體培養(yǎng)。
4、菌落平板（冰袋運(yùn)輸，存于4℃，保質(zhì)期7天）直接挑取單菌落至液體培養(yǎng)基中。
5、液體質(zhì)粒（冰袋運(yùn)輸，存于-20℃，保質(zhì)期90天）單獨(dú)提取的液體質(zhì)粒收到后可直接使用。
6、濾紙質(zhì)粒（常溫運(yùn)輸，存于-20度，90天保質(zhì)期，請務(wù)必轉(zhuǎn)化挑單克隆培養(yǎng)，不要直接使用和測序）
收到貨后將濾紙畫圈部分剪下放入EP管中，加100ul無菌水將濾紙浸濕并浸泡5min，吸取5ul質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，離心全涂。
轉(zhuǎn)化圖片：

pCR-BluntII-TOPO-WNT3A(human)質(zhì)粒提取步驟：（本步驟僅做示例，非該產(chǎn)品實(shí)際提取步驟）
實(shí)驗(yàn)原理：
        堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA 與線性染色體DNA 在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們。在pH 值介于12.0 ～12.5 這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA 的氫鍵會被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互盤繞，仍會緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH 4.8 的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pH 至中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA 的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體DNA 的兩條互補(bǔ)鏈彼此已分開，復(fù)性就不會那么迅速而準(zhǔn)確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA ，蛋白質(zhì)-SDS 復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。
二、操作步驟：
        1. 準(zhǔn)備20ml滅菌過的培養(yǎng)管，編號，分別加入8ml LB培養(yǎng)基，再加入8µl 相應(yīng)抗生素，可適量多加；
        2. 用10µl 白色槍頭挑取挑取單個(gè)菌落至培養(yǎng)管中，37℃震蕩過夜（274rpm）；
        3. 取2ml過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管中，室溫10000rpm離心2min，去上清；（可重復(fù)步驟2，直至菌液離心完）（去上清時(shí)用紙吸一下）
        4. 向留有菌體沉淀的離心管中加入250µl Buffer P1（含RNase A），使用移液槍充分混勻，懸浮菌體菌體；
        5. 向離心管中加入250µl Buffer P2，溫和地上下顛倒混勻4~6次，獲得澄清的裂解液；（劇烈混合會使剪切染色體DNA，降低質(zhì)粒純度）
        6. 向離心管中加入350µl Buffer N3， 立即溫和地上下顛倒混勻4~6次，此時(shí)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。室溫10000rpm離心15min；
        7. 小心將步驟6中所得的上清液轉(zhuǎn)移至潔凈的吸收柱中。要保證沒有吸入沉淀和細(xì)胞碎片。室溫10000rpm離心1min，至裂解物通過吸收柱,倒掉收集管中的廢液；
        8. 向吸附柱中加150µl Buffer PB，10000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液；
        9. 向吸附柱中加400µl  Buffer PW（檢查是否加入無水乙醇），10000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液。再空離一次，2min（此時(shí)可以加熱 Buffer EB，65~70℃）；
        10. 將吸附柱置于一個(gè)新的離心管中，打開蓋子，吹風(fēng)4min左右（確保乙醇被去除，乙醇會影響下面的步驟）；
        11. 向吸附柱的吸附膜中間部位加90µl Buffer EB（pET系列拷貝數(shù)低，加EB 70μl即可），室溫靜置2min。10000rpm離心1min；
        12. 把液體倒回吸附柱，在10000rpm離心1min；
        13. 混合質(zhì)粒至一個(gè)離心管中，做好標(biāo)記，開蓋室溫放置兩小時(shí)左右。-40℃保存質(zhì)粒。
三、注意事項(xiàng)：
        1.使用之前，把試劑盒中的一小管RNA酶加入Buffer P1， 4℃保存。
        2.Buffer EB在65~70℃水浴預(yù)熱，可以增加提取效率。
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